Recuperação da Eficácia Antienvelhecimento

Robert Holtz
BioInnovation Labs, Inc. Denver CO, EUA

 

Fragmentação do Colágeno

Mediador da Fragmentação do Colágeno

Modelos In Vitro da Fragmentação do Colágeno

Destaques e Conclusão

Referências

artigo publicado na revista Cosmetics & Toiletries Brasil, Jul/Ago de 2019, Vol. 31 Nº 4 (pág 18 a 20)

     Provavelmente, você conhece a lenda do rei Arthur e sua interminável busca pelo Santo Graal. Em Excalibur (1981), do diretor John Boorman, um dos muitos filmes já feitos sobre essa lenda, o segredo do Graal é que, simplesmente, Arthur e a Grã-Bretanha são uma coisa só. Quando um está em guerra, o outro também está e, infelizmente, quando um deles sofre, o outro sofre junto. Essa é uma belíssima ilustração de um dos significados da palavra interdependência, o de que qualquer alteração de um dos parceiros pode ter impacto significativo sobre o outro.

     E o que isso tem a ver com os cuidados com a pele? Tem muito a ver, quando examinamos minuciosamente o inter-relacionamento entre a camada dérmica da pele e o principal tipo de célula que a constitui – o fibroblasto dérmico.

     A camada dérmica da pele é formada pela densa matriz extracelular (ECM, na sigla em inglês), composta de colágeno e proteínas da elastina, que agregam resistência estrutural e elasticidade à pele, e de glicosaminoglicanos, proteoglicanos e glicoproteínas.

     De todos esses componentes, o colágeno é destacadamente o mais abundante, representando cerca de 90% do peso da pele seca, sendo o colágeno tipo I a forma predominante.1

     Já se sabe que a principal fonte de produção de todos os componentes da ECM são os fibroblastos dérmicos, cuja taxa de produção é controlada por diversos fatores hormonais, autócrinos, parácrinos e físicos. Aumentar a produção desses componentes da ECM é uma das principais metas dos ingredientes ativos dos cosméticos, pois a inevitável redução de sua produção causada pelo envelhecimento e pela exposição ao sol está intimamente relacionada com a indesejável formação de pés de galinha e de outras rugas, e com a flacidez e o afinamento da pele. Isso ajuda a sustentar esse setor da indústria de cosméticos. Contudo, infelizmente, com muitíssima frequência, o foco da indústria está apenas no fibroblasto quando planeja realizar algum experimento relacionado ao envelhecimento. Assume que o processo flui somente em um sentido: os ingredientes ativos estimulam o fibroblasto, e, por sua vez, o fibroblasto produz mais dos componentes da ECM alvo, e o componente da ECM percorre o caminho de volta à ECM,2 finalizando o processo.

     Fundamentalmente, é assim que funciona a maioria dos experimentos in vitro, e esse é um bom modelo para pesquisarmos a eficácia in vitro em indivíduos m0ais jovens. Contudo, o processo torna-se imensamente mais complicado com o envelhecimento da pele causado pelo próprio tempo e com sua exposição ao Sol. Sob essas condições, a ECM é danificada e esse dano pode ter efeito de retorno sobre o fibroblasto. Esse dano pode gerar consequências adversas drásticas no fibroblasto, por exemplo, estimular a produção de MMP (sigla em inglês para metaloproteinase da matriz), interrompendo os caminhos da síntese do colágeno e até levar o fibroblasto ao envelhecimento precoce.2

     Em suma, a ECM danificada sinaliza para o fibroblasto para que este não apenas interrompa os caminhos responsáveis pela síntese de componentes da ECM, mas também para que não responda a nenhum estímulo que poderia recuperar esses caminhos. A lista desses estímulos inclui ingredientes ativos de cosméticos.  Assim, a eficácia desses ativos diminui à medida que a idade do usuário aumenta.

     Qual tipo de lesão à ECM estaria associado a esses efeitos adversos nos fibroblastos? Será que é possível prevenir ou deter esses efeitos?



Fragmentação do Colágeno

     Uma das mais importantes formas de dano à ECM, que ocorre com o envelhecimento e exposição solar, é a fragmentação do colágeno. Presume-se que o mecanismo de partida desse dano seja a formação de ROS (sigla em inglês para espécies reativas de oxigênio).3 Com o envelhecimento cronológico, a formação de ROS intracelular ocorre cada vez mais lentamente e é resultado das funções celulares normais, como o metabolismo mitocondrial. Por outro lado, a formação de ROS pode aumentar rápida e significantemente com a exposição da pele à radiação UV. Infelizmente, a pele submetida ao envelhecimento cronológico e à exposição à UV pode apresentar efeito cumulativo dessas duas fontes de ROS.

     Em resposta às ROS, os fibroblastos dérmicos reduzem a produção de colágeno e aumentam sua produção de MMP1. A MMP1 é essencial para dar início ao processo de degradação do colágeno, pois ela cliva o único local específico na fibrila do colágeno, o que dá acesso à entrada de outras MMPs, ou seja, de MMP3 e MMP9, o que degrada ainda mais a fibrila do colágeno.4 Porém, as áreas onde o colágeno se liga covalentemente com outras fibrilas de colágeno são altamente resistentes à degradação enzimática. Dessa forma, esse pequeno lixo formado por fragmentos do colágeno não pode ser removido e, para todos os objetivos práticos, permanece na ECM, onde vai se acumulando com o passar do tempo.

     Além dos efeitos na produção de MMP1, a exposição dos fibroblastos dérmicos à ROS também reduz a produção de colágeno. Isso limita a substituição do colágeno que foi afetado pela atividade da MMP, levando a um desequilíbrio entre a decomposição e a síntese do colágeno, o que causa perda de colágeno ao longo do tempo. Igualmente, por causa dos fragmentos de colágeno deixados na ECM pela decomposição incompleta das fibrilas de colágeno pelas MMPs, o colágeno produzido pelos fibroblastos não consegue ser depositado de maneira organizada.

     Infelizmente, embora as ROS possam ser responsáveis pelo início da fragmentação, em seguida, o processo passa a ser autossustentável. Fibroblastos se unem às fibrilas do colágeno presente na ECM de uma forma que lembra uma aranha caminhando em sua teia. Esse contato é mediado por integrinas, proteínas da transmembrana que se conectam à ECM, no exterior dos fibroblastos, e ao citoesqueleto da actina, e a vários sistemas mensageiros secundários, no interior dos fibroblastos.

     Conforme a fragmentação do colágeno aumenta, o número de locais de ligação dos fi broblastos, na porção da matriz do colágeno, diminui. Essas ligações com a ECM são importantes porque elas aplicam uma tensão sobre a célula, o que é essencial para o funcionamento normal dos fibroblastos.5,6 Sem essa tensão sobre os fibroblastos, a produção de MMP aumenta, interrompendo os caminhos da síntese do colágeno.3 Assim, o ciclo de fragmentação do colágeno começa a se autoperpetuar, o que ocorre lentamente no início e a taxa de fragmentação vai aumentando devido ao acúmulo de fragmentos de colágeno e pela maior exposição à ROS.

 



Mediador da Fragmentação do Colágeno

     O mecanismo pelo qual a formação de ROS dentro dos fibroblastos induz a elevação da produção de MMP1 e a queda da produção de colágeno parece ser mediado, em parte, pela proteína 61, rica em cisteína (CCN1), membro da família das proteínas CCN.7,8 A CCN1 pode ser sintetizada e secretada por fibroblastos dérmicos, e sua expressão e secreção pelos fibroblastos dérmicos são significantemente aumentadas na pele envelhecida cronologicamente e/ou por radiação.9 Assim que é secretada, a CCN1 pode exercer efeito autócrino/parácrino, ligando-se às integrinas na membrana dos fibroblastos, ativando os caminhos intracelulares que aumentam a produção de MMP1 e inibindo os caminhos associados com a produção de colágeno.2 Os efeitos adversos da CCN1 no metabolismo do colágeno nos fibroblastos podem ser prevenidos pelo bloqueio da integrina αVβ3,10 sugerindo que o caminho da CCN1 pode ser um alvo atraente para novos ingredientes ativos antienvelhecimento.3



Modelos In Vitro da Fragmentação do Colágeno

     Para o estudo dos efeitos do colágeno fragmentado nos fibroblastos dérmicos, um dos principais modelos usados na literatura é a malha do colágeno. Essencialmente, malhas de colágeno são géis de colágeno em 3D espalhados em fibroblastos humanos, ou seja, são um modelo simplificado da camada dérmica da pele humana. O gel de colágeno é geralmente preparado com colágeno tipo I (colágeno de rabo de rato), que é misturado a um meio de cultura de célula e que tem seu pH justado, e que depois é incubado para promover a polimerização do colágeno.11 Depois de o colágeno ter sido polimerizado, ele pode ser digerido pela MMP1 para promover sua fragmentação, e, em seguida, ele pode ser semeado com fibroblastos dérmicos. Os fibroblastos que são cultivados em malhas de colágeno, com fragmentação do colágeno, apresentam várias características associadas à pele envelhecida, como maior ROS intracelular, maior conteúdo de proteínas oxidadas e maior produção de MMP1.11 Os fibroblastos desse modelo podem ser mais resistentes a ingredientes ativos que promovem o estímulo do colágeno. Portanto, esse modelo oferece a possibilidade de testar ativos solúveis no meio de cultura, em um ambiente dérmico que melhor mimetize a pele envelhecida. Ele também pode fornecer melhor representação da eficácia in vivo desses ativos em comparação com as tradicionais culturas de camada única.

     Outros modelos usados para avaliar o impacto dos ingredientes ativos na pele envelhecida que está sofrendo os efeitos da fragmentação do colágeno são os modelos de tecido de espessura plena (como o Epiderm Full Thickness model, da MatTek).

     Ao contrário do modelo de malha de colágeno, esses modelos de tecidos da pele possuem tanto a camada dérmica quanto a epidérmica. A camada dérmica é essencialmente a mesma da malha de colágeno que foi descrita anteriormente: é um gel de colágeno tipo I (não fragmentado) semeado com fibroblastos da derme humana. Todavia, esses modelos também possuem uma camada epidérmica funcional que possibilita a aplicação tópica de formulações, permitindo que ativos cosméticos sejam aplicados de maneira idêntica à forma como seriam aplicados comercialmente. Tendo em vista que o colágeno dérmico dos modelos de tecido de espessura plena não é fragmentado, pode-se adicionar CC1 diretamente ao meio de cultura para que se obtenha um comportamento dos fibroblastos semelhante ao seu comportamento na pele envelhecida (ou seja, com maior produção de MMP1 e menor produção de colágeno). Com esse modelo, podem-se observar a queda do colágeno tipo I e o aumento de MMP1 no tratamento com a CCN1,12. Isso sugere que esse pode ser um excelente modelo in vitro de pele envelhecida para a realização de testes de produtos de aplicação tópica.

     Finalmente, tendo em vista que a CCN1 parece ser um mediador importante na fragmentação do colágeno, podem ser conduzidos estudos para determinar ingredientes ativos que possam prevenir a indução da CCN1. A expressão da CCN1 nos fibroblastos dérmicos, aparentemente, é iniciada pela exposição à ROS. Portanto, o tratamento de fibroblastos dérmicos em uma cultura de camada única, com oxidantes, como peróxido de hidrogênio ou com radiação UVB, seria sufi ciente para dar início ao processo de produção e secreção de CCN1.7,13 Esse simples modelo in vitro pode ser excelente para testar ativos, especialmente antioxidantes, para que sua capacidade de prevenir a produção da CCN1 seja conhecida, uma vez que essa produção pode ser facilmente medida com kits Elisa, disponíveis no



Destaques e Conclusão

     A fragmentação do colágeno ocorre lentamente, mas causa a degradação inevitável da ECM associada ao envelhecimento cronológico e por exposição da pele à radiação solar. Esse dano progressivo não causa apenas alterações em cosméticos e patologias associadas à ECM e ao envelhecimento, mas também impede significantemente a função dos fibroblastos dérmicos e faz com que estes envelheçam precocemente e não respondam aos estímulos que poderiam ajudar a corrigir alterações na ECM.

     Felizmente, existem modelos in vitro que podem ajudar a selecionar ingredientes ativos para retardar ou impedir a fragmentação do colágeno, por meio da inibição do ciclo de produção da MMP1 e da inibição da síntese do colágeno, ou da mitigação dos fatores que possam contribuir para a perda da função dos fibroblastos, como a CCN1.



Referências

1. Uitto J. Connective tissue biochemistry of the aging dermis. Age-related alterations in collagen and elastin. Dermatological Clinics 4:433-446, 1986

2. Quan T, Fisher GJ. Role of age-associated alterations of the dermal extracellular matrix microenvironment in human skin aging: a mini-review. Gerantology 61:427-434, 2015

3. Fisher GJ, Sachs DL, Voorhees JJ. Ageing: collagenase-mediated collagen fragmentation as a rejuvenation target. Br J of Dermatology 171:446-449, 2014

4. Overall CM. Molecular determinants of metalloproteinase substrate specificity: matrix metalloproteinase substrate binding domains, modules, and exosites. Molecular Biotechnology 22:51-86, 2002

5. Cole MA, Quan T, Voorhees JJ, Fisher GJ. Extracellular matrix regulation of fibroblast function: redefi ning our perspective on skin aging. J of Cell Communication and Signaling 12:35-43, 2018

6. Makhija E, Jokhun DS, Shivashankar DV. Nuclear deformability and telomere dynamics are regulated by cell geometric constraints. Proc from the National Academy of Science Supplement E32-E40, 2015

7. Qin Z, Robichaud P, He T, Fisher GJ, Voorhees JJ, Quan T. Oxidant exposure induces cysteine-rich protein 61 (CCN1) via c-jun/AP-1 to reduce collagen expression in human dermal fibroblasts. PLoS One 9(12):e115402, 2014

8. Lau LF, Lam SC. The CCN family of angiogenic regulators: The integrin connection. Exp Cell Research 248:44-57, 1999

9. Quan T et al. Elevated cysteine-rich 61 mediates aberrant collagen homeostasis in chronologically aged and photoaged human skin. Am J of Pathology 169:482-490, 2006

10. Qin Z, Fisher GJ, Quan T. Cysteine-rich protein 61 (CCN1) domain-specific stimulation of matrix metalloproteinase-1 expression through αVβ3 integrin in human skin fibroblasts. The J of Biol Chem 288(17):12386-94, 2013

11. Fisher GJ et al. Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin. The Am J of Pathology 174(1):101-114, 2009

12. Quan T, Qin Z, Shao Y, Xu Y, Vorrhees JJ, Fisher GJ. Retinoids suppress cysteine-rich protein 61 (CCN1), a negative regulator of collagen homeostasis, in skin equivalent cultures and aged human skin in vivo. Exp Dermatology 20(7):572-576, 2011

13. Quan T et al. Ultraviolet irradiation induces CYR61/ CCN1, a mediator of collagen homeostasis, through activation of transcription factor AP-1 in human skin fibroblasts. J of Inv Dermatology 130(6):1697-1706, 2010.

Publicado originalmente em inglês, Cosmetics & Toiletries 134(5):34-40, 2019

 

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