21 de Agosto de 2018

Equilíbrio da Microbiota para Benefício da Pele

 

 
Stefan Hettwer, Emina Besic Gyenge, Brigit Suter, Sandra Breitenbach, Barbara Obermayer
Rahn AG, Zurique, Suíça

Objetivos

Materiais e Métodos

Resultados

Discussão

Conclusão

Referências

artigo publicado na revista Cosmetics & Toiletries Brasil - Jul/Ago 2018 Vol. 30 Nº 4  (pag 49 a 54)
    A pele é o nosso maior órgão, com uma superfície de aproximadamente 1,7 metro quadrado. Ela nos protege de influências externas, é importante para a termorregulação e é definitivamente fundamental para a aparência. No entanto, nossa pele não é só nossa. Bilhões e bilhões de pequenos companheiros estão se acomodando na superfície da nossa pele: os microrganismos. No total, cerca de 100 bilhões de bactérias e fungos usam nossa pele como seu habitat.1 Esse número incrivelmente grande corresponde exatamente à totalidade das nossas células da pele.2

   Os avanços que ocorrem recentemente as técnicas de análise do microbioma revelaram uma diversidade bacteriana muito maior na pele em comparação à detectada pelos métodos tradicionais em cultura. Em nossos estudos sobre a pele propensa à acne, detectamos bactérias de 6 filos, mais de 80 famílias e não menos do que 500 espécies diferentes de bactérias. Pode-se imaginar que isso seja apenas uma fração do que pode ser encontrado na pele normal. Além disso, a pele de indivíduos de diferentes etnias e que vivem em diferentes continentes pode abrigar espécies ainda mais distintas.

   A microflora da pele é uma proteção importante contra agentes externos potencialmente prejudiciais. Ao ocupar todos os nichos da pele, a colonização por bactérias patogênicas é fortemente reduzida. Nosso suor também desempenha um papel importante no fornecimento das melhores condições para a microflora benéfica, tornando o pH levemente ácido na superfície da pele.3
 

   A microflora também é responsável pelo típico odor de um ser humano. Especialmente em áreas úmidas, onde as glândulas sudoríparas apócrinas secretam uma composição especial de sebo, os estafilococos, os Corynebacterium e os bacilos degradam o sebo, o material das células mortas e os componentes da superfície da pele. Ao liberar seus metabólitos, é produzido o odor corporal típico de um ser humano (Figura 1).

Alterações na pele devido ao desequilíbrio da microflora

Uma microflora desequilibrada pode ser a razão de ocorrerem certos problemas de pele, como acne, eczema atópico e infecções fúngicas. No entanto, ela não é a causa raiz dos problemas de pele, mas reage às suas funções desreguladas.

   Tipicamente, os microrganismos respondem aos “nutrientes” da pele. No caso da pele oleosa, existe muito sebo, o qual estimula o crescimento de estafilococos e de Propionibacterium. Assim, aprisionados em zonas anaeróbias de poros entupidos da pele devido à hiperqueratinização, esses microrganismos são os principais responsáveis pela formação de manchas inflamatórias e de acne.

   Por causa da superprodução de sebo, o ducto sebáceo é preenchido com excesso de sebo e queratinócitos mortos. A oxidação transforma a textura gordurosa do sebo em uma consistência de cera e a melaninade queratinócitos mortos é oxidada e se torna preta. Isso é reconhecido como comedões (pontos pretos) na face. O sebo subsequente ficará preso em um tubo anaeróbico. Essa é a melhor condição para a colonização de Propionibacterium acnes, uma bactéria gram-positiva anaeróbica que se fixa nas partes ricas em sebo do corpo. Com densidade estimada de 100 a 1.000.000 por centímetro quadrado na pele, é responsável por aproximadamente metade da microflora total da pele5 e pode representar mais de 90% da microflora em condições de acne. Esse microrganismo alimenta-se de lipídios e secreta metabólitos, como porfirinas e lipopolissacarídeos, atraindo células da imunidade, que visam combater a infecção bacteriana.6 Em um estágio tardio, uma pústula de acne evolui e rompe a epiderme ao redor da haste do pelo, formando uma cicatriz na pele (Figura 2).

Tratamentos para acne e pele oleosa: equilíbrio da microbiota e reprogramação celular com retinoides

Farmacologicamente, existem duas estratégias principais para combater a oleosidade da pele e o surgimento de espinhas. A primeira é a reprogramação de sebócitos para produzir uma quantidade menor de sebo, nutriente para a P. acnes. A segunda é o controle da excessiva colonização de bactérias por meio do uso de produtos de higienização agressivos contendo, por exemplo, peróxido de benzoíla. Esse tratamento tem como foco a P. acnes, que é a principal causa da reação inflamatória em uma espinha. No entanto, devido à natureza radical do peróxido de benzoíla, toda a microflora da pele é afetada por essa substância. Por isso, um tratamento de limpeza tão severo deve ser conduzido com acompanhamento médico. O uso regular de peróxido de benzoíla também provoca o ressecamento da pele.

   O uso de antibióticos também é comum para combater uma microflora muito desequilibrada. No entanto, utilizar antibióticos de amplo espectro aumenta o risco do surgimento de linhagens de Staphylococcus aureus resistentes, que, de acordo com as últimas escobertas, também se instalam em poros e espinhas.7
 
   Soluções cosméticas para a pele com tendência à acne podem apenas fornecer o arsenal dermatológico para evitar o agravamento de uma condição leve. Como uma microflora saudável é importante para reduzir o crescimento de espécies nocivas. Portanto é fundamental escolher moléculas inteligentes que tenham como alvo uma subpopulação específica de bactérias, no caso da pele oleosa predominantemente a P. acnes e, em áreas úmidas, a Corynebacterium spec., que são responsáveis pelo surgimento do mau odor. Outras espécies não devem ser ou são pouco afetadas por esses tratamentos, para se manter uma microflora balanceada. Assim, devem ser encontrados ingredientes alternativos e de ação seletiva para cosméticos.

 

Objetivos

  Um extrato em propilenoglicol, das folhas de M. cochinchinensis, tem a marca comercial Seboclear-MP (Rahn AG, Zurique, Suíça) e INCI name: Propanediol (and) Bioflavonoids. Como moléculas ativas principais, foram identificadas as isoflavonas preniladas isolupalbigenin, 6,8-diprenylorobol e 6,8-diprenylgenistein. Elas têm em comum o núcleo da isoflavona, com dois grupos prenila ligados em diferentes posições (Figura 3).

   As isoflavonas, uma subclasse dos bioflavonoides, são metabólitos secundários vegetais que defendem a planta contra patógenos. Assim, são destinadas a atuar em formulações cosméticas como ingredientes de equilíbrio para a microflora da pele, sendo que o extrato das folhas de M. cochinchinensis foi testado in vitro e in vivo para comprovar sua eficácia.


Materiais e Métodos

Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) em várias linhagens bacterianas da microflora da pele
O ativo foi diluído em diferentes concentrações em meio Müller-Hinton e o crescimento das linhagens bacterianas selecionadas foi analisado em condições aeróbias ou anaeróbias para P. acnes por 24-48 horas. A concentração mínima do ativo na qual não se observou crescimento bacteriano correspondeu à concentração inibitória mínima (CIM).

Estudos in vivo
Os estudos in vivo foram realizados seguindo os princípios de boas práticas de laboratório (BPL) e de boas práticas clínicas (BPC) e estavam em conformidade com os requisitos do sistema de garantia de qualidade. Esses estudos estavam de acordo com a Declaração de Helsínque da Associação Médica Mundial. Todos os participantes do estudo assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), informado por escrito no início dos estudos.
 
Determinação do microbioma da pele na pele acneica
Foi realizado estudo de aplicação de uma formulação contendo 3% do ativo durante 28 dias, em três voluntárias com pele acneica e oleosa, 18-45 anos (média de 28,7 anos). A formulação-teste foi aplicada duas vezes por dia no rosto das voluntárias. No dia 0 e dia 28, amostras de swab da superfície da pele na área nasolabial foram coletadas. A análise do sequenciamento de 16S rRNA identificou a diversidade microbiana da pele. 
 
Determinação da densidade de Corynebacterium spec. e o odor das axilas
Foi realizado um estudo controlado por placebo para a comprovação do claim em desodorantes com 20 voluntários (11 homens e 9 mulheres), com idades entre 35 e 64 anos (média de 52,6), com odor axilar pronunciado. Após 10 dias de aplicação de uma formulação de sabonete padrão, os indivíduos com odor axilar pronunciado lavaram suas axilas de forma definida no instituto de teste (pré-condicionamento). Após 6 horas e 24 horas, três pessoas avaliaram o mau odor cheirando a axila dos voluntários.

Após 24 horas, suas axilas foram lavadas novamente e um spray com ou sem 1% do ativo foi aplicado, respectivamente, em cada uma das axilas. O surgimento do mau odor foi avaliado da mesma forma que anteriormente. Após 6 horas da aplicação, amostras de swab foram coletadas para investigar as unidades formadoras de colônia (UFCs) das bactérias e das bactérias corineformes em meio ágar base sangue columbia.

Efeito do ingrediente ativo na pele propensa à acne
Em um estudo duplo-cego, controlado por placebo, hemiface e randomizado, 21 mulheres com pele caucasiana oleosa saudávelcom idades entre 16-24 anos (média de idade de 19,4 anos) aplicaram uma emulsão sem (placebo) ou contendo 3% do ativo, duas vezes ao dia em meia face. Os pontos inflamatórios foram avaliados por meio do sistema fotográfico Visia (Canfi eld, Parsippany NJ, EUA), com canal de luz vermelha, e as porfirinas foram detectadas com o mesmo equipamento e com canal de luz UV. 


Resultados

Supressão seletiva de actinobactérias por isoflavonas preniladas

As isoflavonas preniladas de Maclura cochinchinensis alteram a regulação do crescimento da microflora da pele. Dependendo da linhagem bacteriana, elas suprimem o crescimento de bactérias mais ativas, como a P. acnes, principal bactéria agravante da acne, e a Corynebacterium spec., que se prolifera em áreas úmidas do corpo, responsáveis pelo surgimento do mau odor (Figura 4). Na concentração de 0,5-1% do ativo é eficaz contra essas actinobactérias desfavoráveis. Em concentrações mais altas, o crescimento de estafilococos e de Bacillus subtilis também é regulado.
 

Isoflavonas preniladas regulam o microbioma da pele in vivo
A análise da microflora da pele nos indivíduos com lesões de acne antes da aplicação do ativo comprovou que havia desbalanço de microrganismos, em cada participante do estudo. A maioria das bactérias da pele encontrada foi representada pela Propionibacterium spec. (87-98%), das quais 99% eram P. acnes. Em todos os participantes do estudo, a abundância de actinobactérias, da qual pertencem a Propionibacterium sp. e a Corynebacterium sp., foi reduzida pela aplicação do ativo. Após 28 dias, a quantidade de P. acnes diminuiu 10% ou 12% em 2 dos 3 participantes do estudo. Em contraste com isso, a biodiversidade nos filos de firmicutes (por exemplo, Staphylococcus sp. e B. subtilis) e proteobactérias aumentou. Assim, o índice de Shannon estava aumentado para todos os participantes do estudo, indicando um microbioma diversificado a caminho de uma microflora normal e equilibrada da pele (Figura 5). Esse resultado está de acordo com o perfil de especificidade antimicrobiana determinado na Figura 4. Por causa da alta diversidade individual e ao pequeno número de participantes do estudo, a significância estatística dos resultados ainda não foi alcançada (Figura 6).
Isoflavonas preniladas reduziram a Corynebacterium in vivo e o mau odor nas axilas
A análise das amostras de swab após 6 horas de aplicação da formulação-placebo ou com Seboclear-MP nas axilas revelou redução das bactérias Corynebacterium em 44,4% em comparação ao placebo, devido à atividade das isoflavonas preniladas presentes no ativo (Figura 7). Após 6 horas do tratamento com 1% do ativo, a fração de Corynebacterium era de 5% entre todas as unidades formadoras de colônia, sendo no grupo placebo um total de 9%. Esses valores corroboram os resultados encontrados na avaliação olfativa do odor das axilas, sendo as bactérias Corynebacterium responsáveis pelo surgimento do mau cheiro nessa região. As axilas não tratadas desenvolveram odor pronunciado após 24 horas, com valor de aproximadamente 3,5. Após a aplicação de um spray desodorante, o valor foi reduzido para 1,2 unidade para o grupo tratado e para 0,83 unidade para o placebo (Figura 8), demonstrando sua performance superior após 6 horas. Depois de 24 horas, o mau odor nas axilas tratadas com o ativo ainda diminuiu significativamente em 0,25 unidade, enquanto o placebo retornou ao valor inicial. 

 

Isoflavonas preniladas reduzem P. acnes in vivo e os sinais de acne
Enquanto a aplicação da formulação-placebo na hemiface aumentou significativamente a contagem de porfirina (a medida da colonização de P. acnes nos ductos sebáceos), a mesma formulação com 3% do ativo diminuiu, significativamente e de forma contínua, esse parâmetro no grupo tratado com o ativo em relação ao placebo (Figura 9). O efeito pode ser bem visualizado por meio de imagens obtidas com o canal de luz UV do aparelho Visia (Figura 10).
 
   Sinais inflamatórios (pontos vermelhos) foram medidos com fotografia Visia. Após 28 dias de aplicação, o tratamento com o ativo reduziu em 8% a contagem de pontos vermelhos na pele com tendência à acne. Após 84 dias, os pontos foram reduzidos signifi cativamente em relação ao valor basal e o placebo em 22%, enquanto no grupo-placebo não houve alteração significativa (Figura 11).

 

Discussão

   A pele normal abriga em sua superfície vários microrganismos bacterianos e fúngicos diferentes. Essas linhagens coabitam para criar a microflora benéfica individual. Sob certas condições, o equilíbrio da microflora pode mudar para uma situação desfavorável. O excesso de P. acnes pode causar a acne vulgar e o supercrescimento de estafilococos pode levar à inflamação da pele e à dermatite atópica sob certas condições da pele.3 A Corynebacterium, que se prolifera principalmente em áreas úmidas do corpo, pode causar queratólise exfoliativa plantar. Hiperidrose, odor desagradável e dor são as principais queixas clínicas.

   Os estafilococos e os bacilos são, em circunstâncias normais, desejáveis para que haja uma flora saudável na pele. Como as isoflavonas preniladas atuam seletivamente em Propionibacterium sp. e de Corynebacterium sp. (Figura 4) e não atuam como um antibiótico não seletivo, o desenvolvimento de resistência a antibióticos da S. aureus pode ser excluído. Além disso, a atividade inibitória das isoflavonas preniladas é menor para essa linhagem.

   As isoflavonas preniladas também podem regular o microbioma in vivo na pele oleosa. Uma alta biodiversidade do microbioma da pele reflete uma pele saudável. No caso de pele oleosa e propensa à acne, a biodiversidade é reduzida devido à abundância de Propionibacterium sp., a qual é medida por meio do índice de Shannon. Na pele normal, o índice de Shannon tem um valor de cerca de 6,8.10 Quanto menor a diversidade, menor é o índice de Shannon. Em nosso estudo, o índice de Shannon foi extremamente baixo, de 0,15. Isso mostra que, predominantemente, as linhagens de P. acnes foram coletadas nas amostras de swabs. A razão só pode ser uma condição acneica grave da pessoa testada. No entanto, o tratamento com 3% do ativo por 84 dias levou ao aumento de 73% do índice de Shannon e a uma enorme diversificação de filos bacterianos, exceto ao aumento das actinobactérias, que, ao contrário, diminuíram. Embora o índice de Shannon comprove que a diversidade bacteriana total ainda permanece muito baixa, a tendência de que a microflora da pele se normalize é evidente. O resultado mostra as limitações dos ingredientes ativos cosméticos em relação aos ativos farmacológicos que só podem ser usados sob prescrição médica.
 
   Para investigar o potencial do Seboclear-MP de inibir o crescimento de Corynebacterium sp., foi realizado um teste olfativo. O odor axilar é resultado da decomposição do suor e do sebo por essas bactérias. Curiosamente, o desenvolvimento do mau odor axilar acompanha as alterações hormonais na puberdade. Como é sabido, bebês e crianças não desenvolvem suor com odor forte até entrarem na adolescência. Demonstrou-se que o crescimento das bactérias Corynebacterium sp. foi modulado após o uso do ativo em comparação ao placebo e que essa diminuição de microrganismos corrobora a redução significativa do mau odor nas axilas após 6 horas.
 
   A influência no crescimento de P. acnes foi avaliada em um estudo durante 84 dias, realizado em uma formulação-placebo e com 3% do ativo aplicados na face. Como resultado, as porfirinas, marcadores do crescimento de P. acnes, foram reduzidas em 12% em relação ao valor basal e em 38% em comparação com o placebo. Como consequência, houve diminuição visível dos pontos vermelhos na face. Possivelmente, a presença de P. acnes agrava os processos inflamatórios na pele com tendência à acne, levando ao surgimento de manchas e espinhas.
 
   A redução das Corynebacterium sp. na contagem de porfirinas, no estudo no mau odor axilar e do crescimento de actinobactérias,no estudo facial durante 28 dias, comprova o perfil demodulação no crescimento de microrganismos, comprovado por estudos in vitro.


Conclusão

   É importante reduzir o número de bactérias indesejadas na manutenção de uma microbiota equilibrada, para manter a pele saudável. O crescimento excessivo de P. acnes ou Corynebacterium sp. pode agravar as condições acneicas e o mau odor. O Seboclear-MP atua como um regulador da microbiota, suprimindo seletivamente o crescimento dessas espécies indesejáveis. O número de porfirinas, medida de colonização de P. acnes, foi reduzido, assim como o número de Corynebacterium em testes in vitro e in vivo. Assim, tem-se a redução nos pontos inflamatórios e melhor aparência da pele. A atividade dos bioflavonoides é capaz de modular outros marcadores causadores das condições de pele acneica, bloqueando a 5α-reductase e inibindo as enzimas COX e 5-LOX (dados não mostrados).


Referências

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2. Bianconi E, Piovesan A, Facchin F, Beraudi A, Casadei R, Frabetti F et al. An estimation of the number of cells in the human body. AnnHum Biol 40(6):463-71, 2013
3. Grice EA, Segre JA. The skin microbiome. Nat Rev Microbiol9(4):244-53, 2011
4. Troccaz M, Gaia N, Beccucci S, Schrenzel J, Cayeux I, StarkenmannC et al. Mapping axillary microbiota responsible for body odoursusing a culture-independent approach. Microbiome 3(1):3, 2015
5. McGinley KJ, Webster GF, Ruggieri MR, Leyden JJ. Regional variations in density of cutaneous propionibacteria: correlation of Propionibacterium acnes populations with sebaceous secretion. J Clin Microbiol 12(5):672-5, 1980
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8. Cosseau C, Romano-Bertrand S, Duplan H, Lucas O, Ingrassia I, Pigasse C et al. Proteobacteria from the human skin microbiota: species-level diversity and hypotheses. One Health 2:33-41, 2016
9. Blaise G, Nikkels AF, Hermanns-Le T, Nikkels-Tassoudji N, Pierard GE. Corynebacterium-associated skin infections. Int J Derm 47(9):884-90, 2008
10. Mukherjee S, Mitra R, Maitra A, Gupta S, Kumaran S, Chakrabortty A et al. Sebum and hydration levels in specifi c regions of human face signifi cantly predict the nature and diversity of facial skin microbiome. Sci Rep 6:36062, 2016

 

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